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--- rsv:elisa [2014/06/05 (Thu) 15:39]
mokuda [１.　検定試薬]
+++ rsv:elisa [2025/12/12 (Fri) 15:42] (現在)
kenzi [実際の手順]
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 日本植物防疫協会から市販されているイネ縞葉枯ウイルス検定試薬（ポリクローナル抗体利用DAS-ELISA用セット）を使用します。
-<WRAP round tip 60%>//**__抗体の入手先__**// \\ [[http://www.jppa.or.jp/mailform/form3.html|日本植物防疫協会]]　支援事業部  \\ FAX 03-5980-6753 \\ TEL 03-5980-2183</WRAP>
+<WRAP round tip 60%>//**__抗体の入手先__**// \\ [[https://www1.enekoshop.jp/shop/jppashop/|日本植物防疫協会]]　支援事業部  \\ FAX 03-5980-6753 \\ TEL 03-5980-2183</WRAP>
 ==== ２.　緩衝液、試薬 ====
 （1）炭酸バッファー（0.05M, pH9.6）
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 （3）10%ジエタノールアミン溶液（pH9.8）
 （4）基質溶液
-各試薬の調整法については、[[manuals:elisa|ELISA法]]を参照してください。
+各試薬の調整法については、[[https://ml-wiki.sys.affrc.go.jp/okuda_wiki/manuals/elisa|ウイルス病検定マニュアル：DAS-ELISA]]を参照してください。
 ===== ３.　器具 =====
 （1）96ウェルマイクロプレート
 <WRAP indent>ELISA用のマイクロプレートを使用して下さい。中結合能タイプと高結合能タイプがありますが、RSV検定試薬は高結合能タイプを使用した方が明瞭な発色が得られますので、高結合能タイプを使用して下さい。以下に、問題無く使用できることを確認済みのプレートをリストアップします。その他のメーカーのものについても高結合能タイプであれば問題ないと思いますが、それらを使用する際は事前に、推奨品との比較により問題がないことを確認して下さい。</WRAP>
-<WRAP round tip>//**__推奨マイクロプレート__**// \\
+<WRAP round tip 60%>//**__推奨マイクロプレート__**// \\
 [[http://www.greiner-bio-one.co.jp/products/153.html|Greiner社　No.655061]] <wrap em>（推奨）</wrap> \\
 [[http://www.greiner-bio-one.co.jp/products/153.html|Greiner社　No.762071（脱着可能な8連ウェルとフレームを組み合わせたものです）]] \\
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   - マイクロプレートを逆さにしてウェル内のコーティング液をさっと捨て、マイクロプレートの各ウェルをPBS-Tで3回洗浄する（PBS-Tを適量入れて捨てる、という操作を繰り返す）。洗浄後はプレートをペーパータオルに5回程度たたきつけてウェル内に残った液体を除去する。
   - マイクロプレートの各ウェルにPBS-Tで所定の濃度に希釈したコンジュゲート液（二次抗体液）を50µlずつ入れる。
-  - 各ウェルに虫検体を入れる。虫検体の胸部をピンセットで圧搾してから、ウェル内に投入する。
+  - 各ウェルに虫検体を入れる。虫検体の胸部をピンセットで圧搾してから、ウェル内に投入する。陽性コントロールとして、RSV感染イネまたはRSVを保毒したヒメトビウンカの磨砕液（注）を、陰性コントロールとして無保毒（健全）ヒメトビウンカ成虫を各1ウェル加える。
   - プレートをラップフィルム等で包んで37℃で2時間静置する（4℃で一晩静置でも可）
   - マイクロプレート内のコンジュゲート液と虫検体を捨て、マイクロプレートの各ウェルをPBS-Tで5回洗浄する。
   - 基質溶液を各ウェルに100µlずつ注入し、15−30分後に結果を判定する。
+<WRAP round tip 85%>//**__<del>陽性コントロールの配布</del>__**// <del>農研機構植物防疫研究部門では、簡易保毒虫検定法に使用できる「イネ縞葉枯ウイルス検定用陽性コントロール」を配布しています（公的機関には無償、その他は有償の場合があります）。希望者は、rsv_web@ml.affrc.go.jpまでご連絡ください。</del><wrap em><del>農研機構の研究試料取扱規則に則り配布を行うため、手続きに時間がかかります。余裕を持ってお申し込みください。</del></wrap>
+</WRAP>
 ===== 補足 =====
 （１）コンジュゲート液（二次抗体液）と虫検体を同時にウェルに入れることで、結果の判定までの時間を通常のELISA法と比べて2時間以上短縮できます。通常のELISA法と比べて検出感度は若干低くなりますが、保毒虫検定法として使用する分には全く支障ありません

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