イネ縞葉枯病に関する情報

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====== 簡易ELISAによる同定 ======
===== １.　検定試薬 =====
日本植物防疫協会から市販されているイネ縞葉枯ウイルス検定試薬（ポリクローナル抗体利用DAS-ELISA用セット）を使用する。

<WRAP round tip 50%>//**__抗体の入手先__**// \\ [[http://www.jppa.or.jp/mailform/form3.html|日本植物防疫協会]]　支援事業部  \\ FAX 03-5980-6753 \\ TEL 03-5980-2183</WRAP>
===== ２.　緩衝液、試薬 =====
必要な試薬については、[[rsv:elisa|イネ縞葉枯病ウイルスの簡易保毒虫検定法]]を参照。
===== ３.　器具 =====
必要な器具については、[[rsv:elisa|イネ縞葉枯病ウイルスの簡易保毒虫検定法]]を参照。

===== ４. 実際の手順 =====
  - コーティング液（一次抗体液）を炭酸バッファーで所定濃度に希釈し、マイクロプレートの各穴に100µlずつ分注する。
  - プレートをラップフィルム等で包んで37℃で2時間または4℃で一晩静置する。コーティングしたプレートは4℃で長期保存可能（コーティング液を入れたままの状態で1年程度は保存可能）。
  - マイクロプレートを逆さにしてウェル内のコーティング液をさっと捨て、マイクロプレートの各ウェルをPBS-Tで3回洗浄する（PBS-Tを適量入れて捨てる、という操作を繰り返す）。洗浄後はプレートをペーパータオルに5回程度たたきつけてウェル内に残った液体を除去する。
  - マイクロプレートの各ウェルにPBS-Tで所定の濃度に希釈したコンジュゲート液（二次抗体液）を100µlずつ入れる。
  - 各ウェルに感染が疑われる葉を長さ2〜3mm切り取り、2枚入れる。余ったウェルに陰性コントロールとして、健全なイネの葉を同様に入れる。
  - プレートをラップフィルム等で包んで37℃で2時間静置する（4℃で一晩静置でも可）
  - マイクロプレート内のコンジュゲート液と虫検体を捨て、マイクロプレートの各ウェルをPBS-Tで5回洗浄する。
  - 基質溶液を各ウェルに100µlずつ注入し、30分後に結果を判定する。

===== ５．結果の判定 =====
==== マイクロプレートリーダーを使用する場合 ====
吸光度(波長600nm)が健全の3倍以上の場合、陽性と判定します。

==== 目視判定する場合 ====
ウェルが明確に黄色く発色した場合、陽性と判定します。

====== RT-PCRによる同定 ======
===== １．サンプルの準備 =====
RT-PCRを用いて検定するイネのサンプルはできるだけ新鮮なものを用意する。
葉は黄化〜白化症状を示す株の上位葉が良い。すぐに抽出しない場合は、小分けして-80℃に保存すること。凍結後、溶解したものはRNAが分解しているのであまり良くない。枯死したものからはRNAは抽出できないので注意する。

===== ２．RNAの抽出 =====
RNA抽出について詳しくは[[https://ml-wiki.sys.affrc.go.jp/okuda_wiki/manuals|ウイルス病検定マニュアル ver.3：RNA抽出法]]を参照すること。
<WRAP caution>ここでは、クロロホルムを使わないため取り扱いの簡単な[[http://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html|ISOGEN II]]を用いたプロトコルを紹介する。</WRAP>

===== ３．ISOGEN IIを使った手順 =====
  - イネの葉を0.1g程度((量が多すぎると抽出効率が下がるだけでなく、RT-PCRが阻害されることがあるので注意する))に0.5mlのISOGEN IIを加え、乳ばち等で磨砕する
  - マイクロチューブに移し、蒸留水0.2mlを加え、激しく撹拌する
  - 室温で5〜15分間放置後、遠心分離（15000rpm,10分間）
  - 上澄み（青色）0.5mlを新しいチューブに移し((夾雑物が多く入った場合は、再度遠心分離（15000rpm,1分間）し、上澄みを新しいチューブに移す))、イソプロパノール0.5mlを加え、混和する
  - 室温10分間放置後、遠心分離（15000rpm,10分間）((または、すぐに遠心分離（15000rpm,15分間）でも良い))
  - 上澄みを捨て、70%エタノール0.5mlを加える
  - 遠心分離（15000rpm,1分間）
  - 上澄みを捨て、蓋を開けたまま5分間放置((スピンバキュームがあれば使っても良い))
  - 沈殿を100μlの蒸留水（RNAフリー)に溶解する
  - -20℃で保存（長期保存は-80℃）
===== ４．RT-PCR =====
プライマー
反応条件
RT-PCRおよび電気泳動の実施方法については、ウイルス検出マニュアルを参照

===== ５．結果の判定 =====
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